Reação Em Cadeia Da Polimerase
Hoje, todo o processo de PCR é automatizado a começar por um aparelho chamado termociclador, que permite aquecer e resfriar os tubos de reacção para controlar a temperatura necessária pra cada etapa da reação. Muitos termocicladores modernos fazem uso do efeito Peltier, que permite em tão alto grau o aquecimento como resfriamento dos tubos simplesmente invertendo a corrente elétrica.
Os tubos utilizados para PCR têm uma parede muito fina, o que coopera uma legal condutividade térmica, permitindo que se alcance rapidamente o equilíbrio térmico. Quase todos os termocicladores tem um sistema que aquece a tampa de fechamento com o fim de impossibilitar a condensação sobre isto os tubos de reação.
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Os termocicladores mais antigos não tinham este sistema e bem equipados, o problema da condensação com uma camada de óleo na divisão superior da mistura de reação ou com um tanto de cera dentro dos tubos. Atualmente, existem alguns termocicladores que utilizam ou são capazes de utilizar óleo mineral no tubo de PCR, como os termocicladores de nova geração de fluidez de ar. Geralmente, a PCR é uma técnica comum e geralmente indispensável em laboratórios de procura médica e biológica pra uma vasto diversidade de aplicações. Os quatro desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), substratos para polimerizado novo DNA. Duas ou como iniciadores (em inglês, primers), oligonucleótidos que são, cada um, complementares a uma das duas cadeias do DNA.
São sequências curtas, entre 6 e quarenta nucleótidos, normalmente de dezoito a vinte e dois, que permitem que a polimerase para começar a reação. Devem ser enfrentados e não a muita distância. Delimitam a zona de DNA a amplificar, ou seja, correspondem aos nucleotídeos que definem as extremidades da sequência que se pretende replicar.
MgCl2), ou algum outro cátion divalente. ADN. Atuam como co-fatores da polimerase. Íons monovalentes, como o potássio. Uma solução buffer ou buffer, que mantém o pH adequado para o funcionamento da DNA polimerase. DNA polimerase ou mistura de diferentes polimerases com temperatura ideal cerca de 70 °C (a mais comum é a polimerase Taq). DNA molde, que contém a região de DNA que vai ampliar.
Termociclador, o aparelho que mantém a temperatura necessária em cada uma das etapas que compõem uma etapa. Sensibilidade: menciona-se à quantidade mínima de DNA necessária pra que se produza a amplificação, ou seja, pra adquirir uma banda.
Se relaciona com os falsos negativos, por causa de é possível que uma amostra é positiva, mas seja dada como negativa, pelo motivo de não foi amplificado por não ter quantidade suficiente de DNA. Especificidade: expõe-se à obtenção de um único item amplificado.
é instituída pelo avanço de seus negócios e a especificidade com que se ligam ao DNA molde. Deste jeito, se o avanço de seus negócios têm mais de um blog ao qual se conseguem englobar irá aparecer mais um artefato amplificado. Se relaciona com os falsos positivos, já que é possível que uma demonstração é negativa, porém é dada como positiva já que foi amplificado de uma região de DNA não-alvo ou que não se buscava aumentar. Eficiência: refere-se à amplificação máxima que se poderá adquirir em um estabelecido número de ciclos. Fidelidade: expõe-se aos erros que comete a DNA polimerase durante a amplificação.
Este conceito é de especial importancia no sequenciamento, todavia em outros casos não é tão significativo. Uma boa fidelidade permite impedir falsos positivos e/ou negativos. O procedimento de PCR normalmente consiste numa série de vinte a 35 mudanças repetidas de temperatura chamados ciclos, cada momento costuma consistir em 2-três passos a diferentes temperaturas. A PCR comum se realiza com ciclos que têm 3 etapas de temperatura. Noventa °C), e foi seguido por outro hold ao encerramento do recurso para a extensão de produto conclusão ou o breve armazenamento.
As temperaturas utilizadas e o tempo aplicado em cada tempo dependem de uma grande diversidade de parâmetros. Estes acrescentam a enzima utilizada para a síntese de DNA, a concentração de íons divalentes e de dNTP na reação, e a temperatura de união de que forma, como essa de o comprimento do DNA que se deseja amplificar.